Biserica Mănăstirii Stavropoleos a fost ridicată de arhimandritul (din 1726, mitropolitul) Ioanichie, la 1724, ca loc de rugăciune pentru mica obște de monahi pe care o păstorea, dar și pentru călătorii care erau găzduiți la hanul din incintă.
Inițial, biserica cu hramul „prea slăviților Voevozi Mihail şi Gavriil şi a celui între sfinţi, părintelui nostru Atanasie, patriarhul Alexandriei”, a avut un plan simplu, dreptunghiular, fără abside laterale și fără pridvorul cu coloane bogat ornamentate pe care îl putem vedea acum. În preajma anului 1730, după ce egumenul Ioanichie a primit și alte terenuri în jurul lăcașului de cult, i-a modificat planul inițial, adăugându-i absidele, lărgind altarul și construind pridvorul.

Lucrările, încheiate în 1733, după cum menționează pomelnicul ctitorilor de la Proscomidie, înscrie locașul în seria micilor biserici cu arhitectură de tradiție brâncovenească, care se ridicau în București în prima jumătate a secolului al XVIII-lea. Avea o incintă care cuprindea casa egumenească, chiliile monahilor și un han, în jurul căruia se desfășura o intensă activitate comercială, după modelul marilor hanuri mănăstirești ale acelui timp.
Cu proporţiile sale armonioase, cu bogata decoraţie în piatră și cu faţadele pictate cu medalioane cu sfinți, înconjurate de motive vegetale, este una dintre ctitoriile reprezentative ale Bucureștiului perioadei fanariote.

După demolarea hanului Stavropoleos, în ultimul deceniu al secolului al XIX-lea, biserica a rămas singura mărturie a unei perioade înfloritoare pe care o cunoscuse mănăstirea mitropolitului Ioanichie. Din clădirile din jur nu se mai păstra nimic, motiv pentru care proiectul de restaurare al arhitectului Ion Mincu a inclus nu doar biserica, ci și refacerea incintei. El a proiectat noua incintă, cu portic susținut de coloane, desfășurat pe trei laturi, o clădire specifică stilul neo-românesc, al cărui reprezentant de frunte era. Clădirea ce urma să adăpostească un muzeu de artă bisericească, un atelier de restaurare, locuința și cancelaria parohială.

Cu pietrele de mormânt ale ctitorului și ale altor donatori înmormântați în jurul bisericii, cu cruci și diferite fragmente din piatră (coloane, pisanii, capiteluri, arhitrave) recuperate de la bisericile din preajmă, demolate la sfârșitul secolului al XIX-lea, Ministerului Cultelor și a Instrucțiunii Publice a decis amenajarea unui lapidariu în curtea și incinta recent refăcute de la Stavropoleos.

Acest lapidariu, organizat în jurul anului 1900, dar care a adăugat în timp și alte cruci, recuperate în anii din urmă, din cimitire în care fuseseră înlocuite cu altele noi, păstrează urmele unei istorii aproape 300 de ani. Sunt vestigii de la biserici şi mănăstiri acum dispărute, precum Sf. Ioan cel Mare-Grecesc, Sărindar, Măgureanu, Sf. Nicolae Jitnița, fragmente de frescă extrasă dar și capitelurile în stuc care au împodobit fațadele exterioare ale bisericii, înainte de restaurarea Mincu.

Pictura este realizată în stilul artei de tradiție brâncovenească. Exceptând turla care a fost refăcută și pictată după 1900, se păstrează întreg ansamblu mural originar. Programul iconografic este cel tradițional, cu ierarhii îndreptați spre sfântul agneț din glaful ferestrei, sfinții martiri pe pereții naosului, Învierea și a Doua Venire în abside, scene din viaţa Mântuitorului și a Născătoarei, pe zidul de vest al naosului. Pe arcul triumfal de deasupra iconostasului, sunt redate Duminicile Penticostarului, iar pe cel al naosului scene din ciclul Pătimirii.

În pronaos, sunt pictate cele 24 de scene ale Imnului Acatist și o serie de portrete laice: ctitorii (arhiereul Ioanichie cu frații săi, Panait și Nicolae), domnitorul Nicolae Mavrocordat cu familia, familii de donatori care au făcut danii însemnate, mitropolitul timpului, Daniil al Ungrovlahiei.

În pridvor, sunt reprezentate scene din ciclul Genezei, cele șapte Sinoade ecumenice și minunile Arhanghelului Mihail, într-o desfășurare unică în arta Țării Românești.

Dintre cele 12 iconostase brâncovenești care se păstrează în bisericile din București, cel de la Stavropoleos este unul dintre exemplarele cel mai bine conservate. Cu un repertoriu decorativ în care domină vegetalul sub diferite forme − vrejul de acant, viţa de vie, ştiuletele de porumb, frunza de stejar, tulpina de laur, floarea de chiparos, crinul −, el alătură și motive antropomorfe (Iesei din trupul căruia ies ramurile arborelui), îngeri, coroane, însemne heraldice (stema Țării Româneşti, pajura cu cruce, plasată într-o coroană susţinută de vulturi).

Icoanele aparțin unor medii culturale diferite; cele ale profeților, apostolilor și praznicelor sunt realizate într-un atelier local de tradiție brâncovenească, în timp ce icoanele Mântuitorului și Maicii Domnului cu Pruncul aparțin unui atelier din Kremlinul Moscovei.

Icoanele sfinților ocrotitori (Sfinții Atanasie cel Mare și Haralambie, respectiv Sinaxa Sfinților Arhangheli, cu Sfântul Iustin) au fost lucrate de un pictor contemporan în anul 2007. Ele au fost pictate pentru a include toți sfinții ocrotitori ai bisericii, înlocuind alte două icoane, realizate de „Petru iconar la Marea Rusie”, cele cu Sfântul Haralambie și Sinaxa Sfinților Arhangheli, păstrate acum în colecția mănăstirii.